Partneri
ZDRAVIE.sk Šport7.sk Rodinka.sk Klik-Klinik - online doktori
Internet.sk
Internet.sk ĽudiaĽuďom.sk Fony.sk ephoto.sk Dnes24.sk

Testovanie antimutagénnych vlastností liečiv rastlinného pôvodu

Úvod

Pri vývoji nových liečiv sú testy mutagenity povinné. AMESov test je medzinárodne uznávaný a využívaný pre tento účel. V prípade liečiva rastlinného pôvodu BRASSININU sme tento otestovali na bakteriálnej úrovni z hľadiska jeho možnej mutagenity a súčasne sme otestovali aj jeho antimutagénne vlastnosti. Testovanie na bakteriálnych kmeňoch sme zvolili nakoľko bolo rýchlejšie a lacnejšie, než testy na cicavčej úrovni.

Čo je to Brassinin? Fytoalexín (z gr. phyton - rastlina, alexein - brániť sa) sú to nízko molekulárne, nebielkovinové rastlinné obranné látky, ktoré sa za normálnych podmienok v rastlinách nenachádzajú, ale tvoria sa až po napadnutí rastliny patogénom. Pre niektoré patogény (väčšinou pre parazitické huby, ale aj pre niektoré baktérie) sú toxické. Zaraďujeme ich medzi sekundárne metabolity. Fytoalexíny zahrňujú množstvo rôznych typov látok, ktoré sú druhovo špecifické (napr. terpenoidy, alkaloidy, flavonoidy a podobne).

Sú však málo špecifické na druh patogéna a môžu sa tvoriť aj pri inom druhu stresu (napr. pri postriekaní medenými soľami). Syntéza fytoalexínov sa v rastlinách spúšťa pomocou špecifických látok, ktoré nazývame elicitory. Sú to látky, ktoré dokážu rastlinné bunky rozoznávať svojimi receptormi. Môžu to byť jednak látky uvoľňované z tela patogénna, alebo vzniknuté rozkladnou činnosťou patogénna na bunky rastliny. Tieto látky po naviazaní na receptor spúšťajú v rastlinách poplachový signál. Poplachový signál vyvolá v rastlinách odpoveď vo forme tvorby obranných látok. Po napadnutí niektorej časti rastliny nespúšťa sa len lokálnu obranná reakciu, ale často aj dôjde k spusteniu obranných reakcií v celej rastline, čo nazývame „systémová získaná rezistencia“ V kapustovitých rastlinách je takouto látkou napríklad brassinin – u ktorého boli zistené okrem fungistatických aj antikancerogénne vlastnosti, preto je o testovanie brassininu a príbuzných látok veľký záujem.

Materiál a metóda

Pre paralelné (súčasné) testovanie mutagenity a antimutagénnych vlastností brassininu, sme vytvorili trojstupňovú modifikáciu AMESovho testu.

AMESov test mutagenity na bakteriálnych arteficiálnych kmeňoch Salmonela Typhimurium je dobre prepracovaný a preto sa používa ako orientačný test na zisťovanie mutagénnej aktivity (genotoxicity) chemických látok, liečiv, vzoriek ovzdušia a vody, telových tekutín exponovaných pracovníkov, biologických substrátov, potravín a podobne.

Princíp stanovenia mutagénnych látok vo vyšetrovaných substrátoch AMESovým testom spočíva v tom, že tieto látky vyvolajú u Salmonel génové mutácie, čím dôjde ku strate niektorých špeciálnych genetických, presne definovaných vlastností testovacích bakteriálnych kmeňov. Pôsobením mutagénnej zložky vo vzorke dôjde k tzv. spätnému zvráteniu (reverzii) umelého kmeňa Salmonely, na divokú (t.j. pôvodnú - infekčnú) formu, ktorá sa od arteficiálnej líši podstatne vyšším nárastom kolónií. Podiel počtu kolónií testovaného kmeňa počtom kolónií kontrolného kmeňa (RT/RC) nám potom určuje úroveň mutagenity testovanej vzorky.

Trojstupňová modifikácii Amesovho testu sa odlišuje od základnej dvojstupňovej tým, že okrem testovania v 1. stupni ( zisťovanie štandardných vlastnosti testovacieho kmeňa, inertnosť použitého rozpúšťadla - negatívna kontrola, reakcia na známy karcinogén - pozitívna kontrola ), v 2. stupni (zisťovanie škodlivosti (mutagenita) či neškodnosť vzoriek), sme v novej modifikácii AMES testu pridali ďalší 3.) stupeň ( test antimutagénnych, vlastností, alebo inak povedané protektívnej aktivity vzorky (brassininu) a jej metabolitov v prítomnosti pozitívneho karcinogénu).

Testovacím systémom boli Salmonella Typhimurium TA98 a TA100. Vzorky sme testovali bez ako aj po ich metabolickej aktivácii. Vzhľadom na obmedzené množstvo vzorky sme testovali brassinin iba vo dvoch koncentráciách - 50 a 100 mikrogramov.

Výsledky a diskusia

TA 98  +  PK  +  VZORKA
-S9                     
RT/RC
+S9                 
RT/RC
NK 50mg  19 18 20 19   25 25 25 25  
100mg 23 25 24 24   55 55 58 56  
Brassinin - mutagenita
50mg 21 21 21 21 1,01 38 36 37 37 1,48
100mg 25 25 25 25 1,05 38 39 40 39 1,56
PK- daunomycín PK – 2-aminofluoren
PK 50mg  50 58 60 56 2,95 79 78 80 79 3,16
Brassinin  A+ PK: antimutagénny účinok
50mg 49 50 50 50 2,63 75 103 89 89 3,56
TA 100  +  PK  +  VZORKA
-S9  
RT/RC
+S9  
RT/RC
NK 50mg 127 105 86 106   120 109 114 114  
NK100mg 117 96 117 110   203 142 172 172  
Brassinin A - mutagenita
50mg 170 130 150 150 1,41 145 169 157 157 1,38
100mg 80 99 125 101 0,91 129 130 128 129 0,75
PK- benzo-a-pyrén PK – 2-aminofluoren
PK 50mg  642 508 575 575 5,42 760 800 840 800 7,01
Brassinin  A+ PK: antimutagénny účinok
50mg 515 511 522 516 4,86 661 660 645 653 5,72

Skratky:

  • A - brasinin
  • -S9 - bez metabolickej aktivácie
  • +S9 - s metabolickou aktiváciou
  • RT - počet revertant
  • RT/platňa - počet revertant na platňu
  • M - priemerný počet revertant
  • NK - negatívna kontrola
  • PK - pozitívna kontrola /karcinogén/
  • PKD - daunomycín
  • PKA - 2-aminofluorén
  • PKB - benzoapyrén
  • TA 98 - Salmonela Typhimurium kmeň 98
  • TA 100 - Salmonela Typhimurium kmeň 100

Pri porovnaní počtu revertant, vykultivovaných s pozitívnymi karcinogénmi - bez pridania brassininu a s pridaním brassininu na oboch kmeňoch ( s a bez metabolickej aktivácie) sme zaznamenali pokles revertant u vzoriek s brasinínom, no nebola úplne potlačená mutagénna aktivita karcinogénov.

Tieto vlastnosti sa potvrdili aj v niekoľkých pilotných experimentoch na myšiach, v ktorých sa pri súčasnom podaní karcinogénu a brassininu zistilo významné zníženie počtu a malignity nádorov oproti kontrole.

Záver

Na základe výsledkov môžeme konštatovať, že látka brassinin nie je mutagénna a neindukuje mutácie na kmeňoch TA 98 a TA 100 bez a s metabolickou aktiváciou. Mutagénnu aktivitu brassininu sme pri testovaných koncentráciách nezistili na oboch bakteriálnych kmeňoch a ani po metabolickej aktivácii.

Pokaľ ide o modifikovaný stupeň testovania antimutagénnych vlastností, zistili sme, že pri súčasnej kultivácii pozitívneho karcinogénu a vzorky brassininu došlo v porovnaní s pozitívnou kontrolou (RT/RC=2,95) na kmeni TA98 k zníženému nárastu testovaných kolónií bez metabolickej aktivácie (RT/RC=2,63). Aj na kmeni TA100 bez metabolickej aktivácie bola hodnota RT/RC u testovaných kolónií nižšia (4,86) ako u pozitívnej kontroly (5,42). Výrazne nižšia bola hodnota RT/RC (5,72) testovaných kolónií po metabolickej aktivácii oproti pozitívnej kontrole (7,01). Tieto výsledky svedčia o protektívnom potenciáli brassininu a predpokladáme, že pri vyšších koncentrácie brassininu by boli rozdiely výraznejšie.

V našom paralelnom teste sme nezistili mutagénnu aktivitu brassininu a čiastočne sme potvrdili jeho protektívne vlastnosti v prítomnosti pozitívneho karcinogénu. Zároveň sme overili možnosť využitia novej modifikácie AMESovho testu pre orientačné testovanie protektívnych antimutagénnych vlastností látok. Pre potvrdenie antikancerogénneho účinku bude pravdepodobne vždy nutné otestovanie lieky aj na úrovni cicavcov. Využitie testu na zvieratách je však v hygienickej praxi v súčasnosti menej bežné. Doteraz sme Amesov test využívali najviac pri kontrole pitnej, surovej vody, ovzdušia v životnom a pracovnom prostredí, pri kontrole mutagenity moču exponovaných pracovníkov v prevádzkach s rizikom karcinogenity a tiež pri zisťovaní mutagenity potravinových plesní, minerálnych olejov a liečiv.

Význam sledovania genotoxických zložiek pracovného a životného prostredia a používanie viacero biologických testov mutagenity súvisí s tým, že genotoxické faktory prostredia poškodzujú genetický materiál somatických alebo pohlavných buniek a vytvárajú riziko vzniku rakovinových ochorení či vývojových vád.

V závere chcem poďakovať kolektívu pracovníkov UPJŠ PF najmä RNDr. Mariánovi Sabolovi, PhD. ,že nám brassinin na testovanie poskytli.

Vysvetlivky:

Brassinin (fytoalexín) - extrakt z kapustových rastlín,
Fytoalexíny - nízko molekulárne, nebielkovinové rastlinné obranné látky
Mutácia - zmena genotypu jedinca. Môže prebehnúť spontánne, tj. bez vonkajšej príčiny, alebo pod vplyvom pôsobenia prostredia (indukovaná mutácia). Pokiaľ sa táto zmena nevráti do pôvodného stavu (procesom reverzie alebo reparácie mutácií), prenáša sa na všetky bunky (resp. bunkové organely, pokiaľ zmena nastala v mimo jadrovej DNA), ktoré vzniknú delením pôvodnej zmutovanej bunky.
Mutagenita - schopnosť, vlastnosť vyvolať genetickú mutáciu,
Antimutagénne vlastnosti - schopnosť zabrániť vyvolaniu mutácie,
Antikancerogénne - proti rakovinné,
Arteficiálnych kmeňoch - umelo vypestované kmene baktérií,
Génové mutácie – dedične prenosné zmeny v genome,
Revertant - kolónia baktérií, ktorá sa zmenila na divokú formu,
Vykultivovaných - vypestované v kultivačných médiách.

Klik-Klinik

Máte zdravotný problém?

Konzultujte ho so skutočnými odborníkmi

1. internetová klinika Klik-Klinik

Chcem konzultovať

Textová Inzercia

Silvestrovské MEGA pobyty v Dudinciach

Užite si posledné dni v roku 2016 v hoteli HVIEZDA***

Len jeden klik ku zdraviu

Vždy individuálny prístup k liečbe chorôb vášho tela. Fyzioterapia, rehabilitácia, vnútorné lekárstvo, rodinný lekár.

Získajte svoj červený hrnček

Pozrite si našu ponuku a do piatich dní ho máte doma.

Prihlás sa k odberu noviniek a zaujímavých článkov

Testovanie antimutagénnych vlastností liečiv rastlinného pôvodu - ZDRAVIE.sk